Resumen

Cada vez es más evidente la importancia, la elección y el uso de modelos animales en la investigación biomédica. En esta presentación se subraya la relevancia de los animales de experimentación, su clasificación y su validez como modelo en investigación. Asimismo, se rescata la importancia de utilizar Animales de Laboratorio No tradicionales (ALNT) como modelos experimentales en biomedicina. En este sentido, se discute a los marsupiales, y particularmente a los sudamericanos, como ALNT. Se resalta la particular ubicación filogenética de los marsupiales y se resume brevemente las cualidades y usos de las zarigüeyas en la investigación biomédica.

Palabras clave:

Animales de Laboratorio No Tradicionales. Modelos experimentales. Zarigüeya.

¹Parte de la información presentada a continuación forma parte de: “Armadillos y Zarigüeyas como Modelos Experimentales en la Investigación Biomédica: Contribuciones a la Generalización de su Uso”. Tesis Doctoral de la Universidad de Morón. Autor: O. H. Iodice, 2010.

Los Animales de Laboratorio son una de las piezas fundamentales en el desarrollo de las Ciencias Biomédicas. Son usados como modelos para investigar y comprender las causas, diagnóstico y tratamiento de enfermedades que afectan al humano y a los animales. Además de sus importantes aportes en la investigación básica y en la docencia, así como también en el desarrollo, producción y control de medicamentos, alimentos y otros insumos, donde en muchos casos hasta la fecha son insustituibles.
Los avances en la experimentación biomédica y la diversidad de modelos experimentales condujeron al desarrollo de las Ciencias del Animal de Laboratorio.

Modelo Animal

La definición y el uso de modelos animales de experimentación en investigación es una temática de difícil abordaje, tanto en lo semántico como en lo ético.
Podemos convenir que el término Modelo Animal conlleva la detección de una especie o grupo animal que permita abordar la resolución de un problema científico biomédico particular.
Esta postura implica la búsqueda de un ejemplar que admita estudiar de la manera más aproximada, si no total, la condición, proceso o evento que interesa investigar y las modificaciones que se producen por el suceso en estudio.
De todas formas la búsqueda de una definición abarcadora de Modelo Animal tiene sus limitaciones y es un sendero abierto, sobre todo tomando en consideración una definición de un experto en el tema: “El mejor modelo de un gato es un gato, y preferiblemente el mismo gato” (Rosenblueth y Wiener, 1945)
Los modelos animales con fines experimentales han tenido innumerables formas de clasificación. Algunas de ella pueden observarse en la Tabla I.

En este sentido la elección de un modelo animal no tradicional suele permitir el hallazgo de respuestas vedadas hasta ese momento.

Validez del Modelo Animal.

En cuanto a la validez del modelo, tendremos distintos niveles de complejidad:

• Validez interna: implica la fiabilidad y replicabilidad. Fiabilidad en el modelo como instrumento de evaluación y replicabilidad como cualidad de los resultados obtenidos por un modelo en particular.

• Validez de apariencia: es la capacidad del modelo para reproducir las manifestaciones visibles y detectables del proceso o condición a estudiar.

• Validez predictiva: los efectos de la intervención en el modelo serán predecibles en la situación real y pueden llegar a ser extrapolados a situaciones experimentales en otras especies.

• Validez constructiva: reproducción en el modelo de los mecanismos implicados en el proceso o condición a estudiar. Es muy importante, representa la bondad de ajuste entre las variables independientes y dependientes con las hipótesis teóricas.

• Validez externa (generalización): representa el grado en que los resultados obtenidos usando un modelo animal en particular puede ser genralizada y aplicada en todadas las poblaciones y ambientes. Las medidas adoptadas para aumentar la validez interna comprometen la validez externa, pues restringen el rango de la relación entre las variables dependientes e independientes. (Van der Staay y col., 2009).

Animal de Laboratorio No tradicional.

Los Animales de Laboratorio Tradicionales pueden definirse como toda especie usada habitualmente en investigación. Su utilización y aplicaciones están altamente difundidas y se han obtenido de ellos una definición genética y una calidad microbiológica apropiada. Entre los más utilizados figuran los roedores como ratas, ratones, cobayos, hámsteres y jerbos. Lagomorfos como los conejos, En menor cantidad se utilizan otros como perros, gatos, monos, peces, etc.
El término Animal de Laboratorio No Tradicional (ALNT), que desde hace muchos años intento imponer, engloba a todas las especies de vertebrados que históricamente han sido de uso poco común en investigación biomédica, sus parámetros clínico-fisiológicos están poco estudiados y para quienes los criterios sobre manipulación, alojamiento, sanidad, reproducción y procedimiento experimentales resultan ser totalmente innovadores. Entre estos modelos de escasa difusión se destacan los Marsupiales

Los Marsupiales.

Los marsupiales son mamíferos no placentarios, cuyas hembras poseen una bolsa marsupial o marsupio en la zona pélvico abdominal con glándulas mamarias en su interior. Allí las crías pasan gran parte de su desarrollo embriológico. Las proles nacen con un notable grado de inmadurez y alcanzan la bolsa y sus respectivas mamas por sus propios medios (Figura 1).

En la actualidad los marsupiales conforman siete órdenes, tres americanos (Superorden Ameridelphia) y cuatro de la región australásica (Superorden Australidelphia) (Montero y Autino, 2004). Si bien pertenecen al mismo orden, ambos grupos de conspicuos mamíferos son evolutivamente muy diferentes.
De los órdenes americanos nos ocupa el Didelphimorphia compuesto por una sola familia: Didelphidae. En nuestro país existen entre once y doce géneros pertenecientes a esta familia según Mares y Braun (2000) o Massoia y col. (2000). Los géneros a los que se hará referencia en este trabajo son: Didelphis (Figura 2) y Lutreolina (Figura 3).

El género Didelphis cuenta en la actualidad con seis (6) especies representativas. Las diferentes especies del género y su distribución geográfica pueden verse en la Tabla II (Tyndale-Biscoe, 1979; Gardner, 1982; Cerqueira, 1985; Lemos y Cerqueira, 2002).

En la Figura 4 puede verse la distribución aproximada de dos de las especies sudamericanas más difundidas: Didelphis albiventris y Didelphis marsupialis (Adaptado de www.es.wikipedia.org/wiki/Didelphis_albiventris y www.es.wikipedia.org/wiki/Didelphis marsupialis).

El género Lutreolina cuenta con una sola especie representante L. crassicaudata. El la Figura 5 puede verse la distribución aproximada de la misma (Adaptado de www.es.wikipedia.org/wiki/Lutreolina crassicaudata).

Como ya se ha dicho, las zarigüeyas (voz española) u opossum (voz inglesa) son exclusivamente americanos, sólo una especie se distribuye en América del norte, el resto en América Central y la enorme mayoría en América del Sur.
Se las denomina de diferentes formas en toda América, generalmente adoptando términos de origen indígena según las diferentes regiones. Una recopilación de algunas de estas denominaciones puede verse en la Tabla III (Iodice, 1988).

En algunos lugares son llamados “comadrejas”, sin embargo no es una denominación correcta ya que las comadrejas no son marsupiales sino mustélidos (Euterios), distribuidas en la actualidad sólo en Europa. Los primeros españoles llegados a América durante la conquista vieron estos ejemplares similares a los europeos y los denominaron erróneamente. Para atenuar el error suele llamárseles “comadreja americana”.
La ubicación taxonómica de las especies de marsupiales abordadas en este trabajo se muestra en la Tabla IV.

Marsupiales como Animales de Experimentación.

Los marsupiales y particularmente las zarigüeyas, han sido utilizados como modelos experimentales desde hace muchos años. William Jurgelski (Jurgelski, 1971), en EEUU ha sido un pionero en este aspecto; al igual que Jorge Affanni (Affanni y Vaccarezza, 1964 y 1966) en nuestro país.
“… Tendremos cuidado, en cada género de investigaciones, de indicar la elección de animales que convenga hacer. Esto es tan importante, que a menudo la solución de un problema fisiológico o patológico resulta únicamente de una selección más conveniente del sujeto de la experiencia, que torna el resultado más claro o más demostrativo. …” (Bernard, 1959).
No puedo asegurar que los pioneros en el uso de las zarigüeyas como modelos experimentales se hayan inspirado en la aseveración que Claudio Bernard hizo hace más de ciento cincuenta años. Lo que sí puedo afirmar es que han respondido en forma coherente al espíritu que ha regido la labor del padre de la fisiología experimental.
Desde hace varias décadas ha habido un interés renovado en el uso de marsupiales como modelos únicos para la investigación biomédica (Tyndale-Biscoe y Janssens, 1988; Saunders y Hinds, 1997). La mayor parte de los reportes hacen referencia a los marsupiales australianos, con características anátomo-fisiológicas y evolutivas muy diferentes a sus parientes americanos. Y dentro de estos últimos, el opossum de norteamérica (Didelphis virginiana) ha recibido un mayor interés científico hasta la fecha que cualquier otro marsupial de América.
El género Didelphis ha sido un modelo animal difundido entre los gastroenterólogos (Krause y Cutts, 1992; García y col., 1998a, 1998b) y han sido numerosos los estudios referidos a su biología reproductiva (Hartman, 1923 a, 1923 b, 1952), embriología temprana (Hartman, 1916 y 1919; McCrady, 1938), histogénesis y organogénesis (Krause, 1998a y 1998b), neurobiología del desarrollo (Martin y Wang, 1997) y regeneración de la médula espinal (Wang y col., 1998a y 1998b; Martin y col., 2000). Recientemente, una proteína pequeña conocida como factor que neutraliza la toxina mortal (LTNF) fue aislada del suero del oposum. Este factor ha demostrado ser un antídoto potente y eficaz para varias toxinas animales, vegetales y bacterianas. Se cree que la forma sintética de LTNF puede convertirse en una terapia universal contra las toxinas (Lipps, 1999 y 2000).

Zarigüeyas: particularidades y aplicaciones.

Desde hace muchos años varios autores ya han resumido las particularidades y aplicaciones en la investigación de algunos marsupiales americanos (Moore y Bodian, 1940; Krupp y Quillin, 1964; Sherwood y col., 1969; Jurgelski, 1974; Jurgelski y col., 1974; Jurgelski y Porter, 1974; Iodice, 1988).
En la Tabla V puede leerse una brevísima enumeración de las disciplinas biomédicas en que las zarigüeyas han sido propuestas como modelo de investigación
(para más información consultar: Iodice, 1988).

Entre las características más sobresalientes de estos marsupiales que los diversos investigadores ya citados han enunciado, se destacan:

1. Particularidades reproductivas:

1. Tienen un breve período de gestación (12 – 13 días), que figura entre los más cortos para los mamíferos (Figura 6).

2. Poseen una placenta tipo saco vitelino que no se implanta y es cultivable in-vitro.

3. Nacen en un estado de gran inmadurez (semiembrionario).

4. Pasan la mayor parte de su desarrollo ontogénico dentro de la bolsa marsupial, al alcance del experimentador. Hay avanzados estudios con el objeto de obtener un “marsupio artificial”. Este logro, sumado a lo expuesto en los punto b) y c) podrían permitir la crianza de un mamífero desde su fecundación hasta la adultez totalmente in-vitro.

5. El embrión recibe una mínima influencia materna: el microambiente bursal y el aporte de leche (no hay comunicación sanguínea).

6. Posee alantoides que funciona como reservorio urinario, lo que permite el estudio de catabolitos durante la organogénesis.

2. Particularidades ontogenéticas:

La mayor parte de los procesos se producen fuera del útero y al alcance del experimentador (Figura 7), por ejemplo:

• Formación del sistema inmune.

• Desarrollo del cerebro en un 90 % aproximadamente.

• Desarrollo de la función endócrina.

• Formación de tejidos hematopoyéticos.

• Desarrollo de la mayor parte del tejido pulmonar.

Figura 7.
Ejemplar de L. crassicaudata con crías en el interior del marsupio (Instituto de Neurociencia. Bs. As. Argentina).

3. Particularidades morfofisiológicas:

• Poseen un nivel celular y orgánico de gran simplicidad y “esquematicidad” en comparación con euterios (esto facilita el estudio de la relación estructura-función).

• Tienen la capacidad de regenerar miembros amputados mediante técnicas quirúrgicas experimentales durante las primeras etapas de su desarrollo, característica única dentro de los mamíferos.

• Poseen cromosomas de gran tamaño, ideales para estudios genéticos.

• Tienen temperatura corporal inferior a la de la mayoría de los mamíferos, evidentes ciclos térmicos y una particular termorregulación. Lo hacen ideal para el estudio de la evolución filogénica y ontogénica de los mecanismos de la termorregulación. Fueron considerados por mucho tiempo como homeotermos imperfectos.

4. Particularidades neuroanatómicas:

• Presencia de un cerebro lisencefálico, que podría calificarse como “casi reptiliano” (Figura 8).

• Ausencia cuerpo calloso.

• Elevada posición de la fisura rhinalis sobre la cara lateral del hemisferio cerebral.

• Enorme desarrollo relativo de los bulbos olfatorios y tubérculos olfatorios.

• Cara dorsal del tronco cerebral no cubierta por otras estructuras encefálicas como el cerebelo. Esto hace que la zona sea de fácil abordaje quirúrgico preservando otras estructuras.

• Vascularización cerebral basada en el tipo de circulación arterial terminal, en contraste con los demás mamíferos con vascularización de tipo reticular.

Figura 8.
Disección del encéfalo y médula espinal de D. albiventris. Puede verse la lisecefalia del cerebro, el tamaño de los bulbos olfatorios (BO) y la posición de la Fisura rhinalis (FR) (Instituto de Neurociencia. Bs. As. Argentina).

5. Particularidades neurofisiológicas:

• Prolongada plasticidad del recién nacido.

• Conspicuo ritmo EEG theta registrable a nivel neocortical durante el sueño activo o sueño REM.

• Ritmo EEG alpha de los bulbos olfatorios completamente diferente a los ritmos conocidos, con regulación nasal e influencias centrífugas del bulbo.

• Marcada asimetría de la actividad bioeléctrica de la corteza cerebral durante el sueño de ondas lentas.

• Las características neuroanatómicas y neurofisiológicas han sido de gran importancia en neurobiología comparada y, debido a la posición filogénica de los modelos, permite proponer teorías evolutivas relacionadas con el sistema nervioso.

6. Particularidades anatómicas, fisiológicas y comportamentales, los convierten en modelos en fisiopatología humana, por ejemplo:

• La porción inferior del esófago reproduce algunas patologías humanas.

• Desarrolla endocarditis bacteriana espontánea e inducida.

• Presenta estados catatónicos frente a influencias ambientales y experimentales, similares a la catatonía acinética observada en humanos.

• Desarrolla tumores embrionarios inducidos similares a las neoplasias pediátricas (Figura 9).

• Desencadena estados epilépticos motores somatosensoriales ante deficiencias inducidas de lípidos.

• Presenta terminales nerviosas mucocutáneas idénticas a los corpúsculos de Meissner de los primates.

• Presenta vascularización cerebral de tipo terminal comparable a ciertas regiones del hipocampo humano.

• Desarrolla pancreatitis experimentales comparables a la humana.

7. Importancia como modelo en comportamiento animal.

La familia Didelphidae ha sido utilizada como modelo en estudios de comportamiento en los más variados enfoques de la psicología comparada, como por ejemplo:

• Agresividad

• Aprendizaje de reglas

• Aprendizaje espacial

• Condicionamiento operante

• Comportamiento social

• Bases neurobiológicas de la motivación

• Ecología el comportamiento

• Percepción sensorial:

                                        - Visual
                                        -Olfatoria
                                        -Gustativa
                                        -Auditiva

Papini (1986) proporciona una completa reseña sobre los estudios comportamentales de los marsupiales. Por otra parte, la ubicación filogénica de estos mamíferos permite elaborar propuestas para estudios de evolución del comportamiento.

8. Importancia en epidemiología.

Se ha determinado la susceptibilidad espontánea y/o experimental de diversas afecciones infecciosas y parasitarias, zoonóticas y no zoonóticas, que promueven a este grupo como modelo para el estudio de su importancia en la cadena epidemiológica de las mismas. En la Tabla VI pueden leerse algunas de las enfermedades mencionadas.

En cuanto a la rabia, si bien son controvertidos los estudios al respecto, coinciden en que la zarigüeya es relativamente resistente a la infección natural, pudiendo inducirla experimentalmente.
Cabe aclarar que no todas las especies de la familia Didelphidae comparten todas estas características, sin embargo, el estudio de algunas especies poco investigadas puede ofrecer nuevas particularidades que aumenten la lista.

Zarigüeyas: modelo experimental en Sudamérica y Argentina.

Reviste notable importancia la observación que Deane y col. (1984) ha realizado, en Brasil, en cuanto a la epidemiología de la tripanosomiasis chagásica. Ha demostrado que el complejo ciclo vertebrado-invertebrado del Tripanosoma cruzi se cumple en un mismo hospedador: la zarigüeya.
En Brasil se ha adoptado a una especie de este grupo (Didelphis marsupialis) como modelo para el estudio del Tripanosoma cruzi, existiendo una vasta bibliografía al respecto. (Deane y col., 1983, 1986; Dezonne Motta y col. 1983; Jansen y col., 1991; Jansen y Deane, 1994; Carreira y col. 1996).
Tienen particular importancia en salud pública los estudios realizados a campo, en la Argentina, sobre estos marsupiales sudamericanos como estimadores del impacto epidemiológico de algunas enfermedades zoonóticas como Leptospirosis, Salmonelosis Tripanosomiasis chagásica y Trichinelosis (Schweigmann, 1994; Schweigmann y col., 1999; Pérez Carusi, 2006).
El Instituto de Neurociencia de Argentina, dirigido por el Dr. Jorge Mario Affanni, ha sido un adelantado en la región en la utilización de Zarigüeyas como modelos experimentales (Affanni, 1983). Las tareas comenzaron a fines de la década de 1960 en la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad de Buenos Aires. Allí se llegó a contar con un Bioterio especialmente diseñado para estos marsupiales, donde funcionó una Colonia de Zarigüeyas, con mantenimiento y reproducción mediante apareamientos programados de las mismas. En la actualidad, el Instituto tiene su sede en la Facultad de Medicina de la Universidad de Morón, Provincia de Bs. As., Argentina.
Uno de los resultados del Instituto, a través de muchos años de investigación y ensayos, ha sido establecer estándares para el alojamiento, la sanidad, la nutrición y la reproducción (Figura 10) de Didelphis albiventris y Lutreolina crassicaudata en condiciones de bioterio.

Así como también se desarrollaron procedimientos operativos normalizados (PONs) para la contención tanto manual (Figura 11) como química, para la anestesia, analgesia y eutanasia, como así también para numerosos procedimientos quirúrgicos experimentales en dichas zarigüeyas (Petersen y col. 1984; Iodice y col., 1986; Corujeira y col., 1986; Iodice, 1987; Iodice y col., 1988 a, 1988 b, 1988 c; Iodice y Affanni, 1988; Iodice y col., 2007; Iodice, 2010 a, 2010 b; Iodice y col. 2010 a, 2010 b, 2010 c, 2010 d).

Figura 11.
Diferentes modos de contención manual y con elementos intermediarios de ejemplares de D. albiventris (A) y L. crassicaudata (B) (Instituto de Neurociencia. Bs. As. Argentina).

En el Instituto se han estudiado y se continúan estudiando, bajo condiciones de laboratorio, distintas especies de la familia Didelphidae para investigaciones neurobiológicas (Jacob y Onelli, 1913; Affanni y Morita, 1966; Affanni y col., 1967; Affanni, 1972; Scaravilli y col., 1974; Iodice y col., 1985; Iodice y col., 1986; Iodice, 1987; Iodice y col., 1988a, 1988b, 1988c; Golombek y col., 1988; Golombek y col., 1991; Iodice y col, 2007; Iodice, 2010) y de psicología comparada (Papini y col., 1984; Mustaca y Haut, 1985; Papini, 1986).

Pueden citarse como investigaciones más relevantes:

• En la zarigüeya de Argentina se demostró por primera vez la existencia de sueño REM en mamíferos primitivos.

• Se determinó la influencia de los bulbos olfatorios sobre el ciclo vigilia-sueño.

• Se demostró la independencia interhemisférica de la actividad bioeléctrica cerebral por ausencia de cuerpo calloso.

Dentro del mismo Instituto y asociados al equipo del Dr. Osvaldo Tiscornia, se desarrolló un proyecto de investigación sobre pancreatitis aguda inducida. Esta investigación tomó como modelo a la zarigüeya Didelphis albiventris, especie criada y mantenida en la Colonia de Marsupiales del Instituto de Neurociencia. Los resultados de dicha experiencia pueden consultarse en: García y col. (1988a; 1988b; 2001; 2002) y Tiscornia y col. (1999).

Agradecimientos:

Deseo agradecer al Dr. Claudio Cervino por la lectura crítica del manuscrito y las sugerencias aportadas al trabajo.

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Autor:

Omar Héctor Iodice
Médico Veterinario
Doctor de la Universidad de Morón
Docente Adscripto de Fisiología
Facultad de Medicina - UM

Lugar de trabajo: Instituto de Neurociencia. Facultad de Medicina. CONICET - Universidad de Morón. Machado 914, 5° Piso. Morón. (B1708JPD). Bs. As. Argentina Teléfono: (54-11) 5627-2000 Interno 772. oiodice@unimoron.edu.ar, omariodice@yahoo.com.ar