Autor: Jorge M. Sztein DVM, Ph.D
Director, Colony Management and Research Support
Genetic Engineering Core Facility
National Eye Institute
National Institutes of Health

Bldg 7, Room 113
Bethesda, MD 20892-0706

Se denomina Criobiología (crio: frío) al estudio de los procesos que ocurren durante la exposición de material biológico a bajas temperaturas. Los primeros intentos de utilizar frío para la conservación de material biológico se remontan al año 1700, pero fue en realidad en 1949, con el descubrimiento del glicerol como crioprotector, cuando comenzaron a realizarse análisis metódicos sobre congelación. En 1972 D. Whittingham, S. Leibo y P Mazur publicaron los resultados de sus estudios de congelación de embriones de ratón y en 1983 Trounson y Mohr publicaron su trabajo sobre el primer embarazo en humanos logrado con embriones congelados.

La criobiología en realidad es una ciencia en la que muchos de sus avances fueron resultado de métodos de ensayo y error, donde se prueba una opción y se observa si funciona. Si funciona se tiene una solución; si no –en el caso de un error- se intenta otra opción. De esta forma, una vez determinados los parámetros para un tipo de congelación se realizan cálculos basados en la evidencia para analizar minuciosamente las características del fenómeno observado.

En líneas generales en los estudios de criobiología se combinan principios físicos –la temperatura y cambios de estado -, químicos –la composición de los crioprotectores- y biológicos –la célula, tejido u órganos, el tipo y/o especie-. En este capítulo analizaremos como reacciona y las consecuencias que sufre una célula a todo este tipo de cambios.
El proceso de congelación de células, embriones o esperma, consiste en descender de la temperatura corporal o fisiológica en la que se encontraban, cercana a los 38 ºC, hasta temperaturas negativas (bajo cero); en este caso en particular, a la temperatura del nitrógeno líquido (– 196 ºC) en el que finalmente los embriones u otro material biológico serán depositados y mantenidos en estado inanimado por tiempo indefinido.
El efecto físico de una baja temperatura, 0 ºC o menos, sobre una materia líquida es simple: se traduce en la formación de hielo, o sea que el efecto del frío hace que el agua cambie del estado líquido al sólido (hielo). Ahora bien, en muy pocas ocasiones encontraremos en la naturaleza agua en su estado puro, por lo que toda agua que en encontremos en el medio ambiente estará combinada con sales. Por lo tanto es importante comprender que existe una correlación entre la temperatura a la que se somete una solución (agua, solvente) y la concentración de sales que ésta contiene (soluto). Consecuentemente, cuando una solución comienza a congelarse se forman cristales de hielo, lo que indica que a la vez que el agua se congela (cristaliza) la concentración de la solución (relación entre moléculas de agua libre y moléculas de la sal en solución) aumenta. De esta misma forma se puede decir que el punto de congelación de una solución disminuye con el aumento de la concentración de sales. Por ejemplo, el agua pura (0% de sales) se congela a 0 ºC, pero la solución fisiológica, ClNa 9 ‰, comienza a congelarse cerca de los –5 ºC y alcanza su punto eutéctico a –21,6 ºC. El punto eutéctico de una solución es el punto térmico en el cual la solución a consecuencia de la congelación misma alcanzó un punto en el que ya no hay más solvente libre en la solución, o sea que no hay más agua libre ya que toda se ha congelado produciendo como resultado la concentración máxima de las sales que estaban en solución.
Volviendo al ejemplo de la solución fisiológica, ésta comienza a formar hielo (inicio de la congelación) cuando se encuentra entre –2 y –5 ºC, y se congelará totalmente (punto eutéctico) cuando alcanza –21 ºC, variando la molaridad (M: concentración de sales) de la solución inicial de 0.165 M a 6 M.
La concentración de una solución varia acorde a la temperatura a la que se expone; este fenómeno produce a su vez un descenso del punto de congelación, un aumento en el punto de ebullición, y un aumento de la presión osmótica del medio y se denomina propiedad coligativa de una solución.

Principios físicos de la congelación

Para comprender como y porque se produce una congelación, se deben estudiar los principios fisicos del fenómeno de cambio de estado. Para que ocurra este cambio físico, por ejemplo en una célula, se sucede una serie de fenómenos de complementación entre la presión, la temperatura y el volumen de la misma.
La ley de física que analiza este conjunto de variables considerando la presión a la que un cuerpo esta sometido se llama ley de Boyle (1662). La ley original dice que el volumen de un gas contenido dentro de un recipiente disminuye al aumentar la presión sobre el mismo. En el caso de una célula, el volumen aumenta o disminuye acorde a la presión osmótica interna y la del medio que la rodea (externa). En realidad, una célula sólo puede disminuir su volumen hasta cierto límite y el máximo es cuando la célula alcanza el volumen mínimo, que se llama volumen celular no osmótico y es aproximadamente el 20% del volumen inicial (de aquí que sea vox populi que el 80% de la célula es agua).
Esta disminución del volumen celular se representa con un diagrama de fase que grafica los valores recíprocos de la presión osmótica y fue descrito por Jacobus H. Van't Hoff, a quien por este estudio se le otorgó en el año 1901 el primer premio Nobel de Química.

Figura 1: Gráfico de la presión osmótica

Figura 2: Grafica de Boyle -Van’t Hoff de la respuesta de cigotos de ratón (recíproca de la presión osmótica)

Principios biológicos de la congelación

La biología tiene un rol muy especial en la crioconservación ya que todo lo que pretendemos congelar o conservar son básicamente células. Aquí es importante remarcar que también deben estar vivas, ya que las resucitaremos de un estado vegetativo que producirá la congelación, pero no las podremos recuperar o revivir si están muertas antes o después de congelarlas.
En realidad todo lo que analizamos en este texto se basa en el estudio de un tipo de célula o una línea celular. En el caso de intentar congelar tejidos, que son un conjunto organizado de distintas líneas celulares del sistema, se complica, ya que en teoría cada tipo de línea celular tiene su propia curva de congelación. Si pretendemos realizar este mismo estudio con órganos, que son un conjunto de diferentes tejidos y con distinta función, el diseño experimental se complica aún más.
Por esta razón el tipo, el origen, el tamaño y el estadío de una célula es importante para determinar cuál es la curva de congelación óptima. En otras palabras, cada tipo de célula tiene su propia curva de congelación, por ejemplo, la congelación de linfocitos es distinta a la de fibroblastos y esta es diferente a un embrión. Si a su vez incursionamos dentro de la propia línea embrionaria, no es lo mismo un oocito u óvulo que un embrión de una célula o cigoto, ni este a su vez es similar a un embrión de dos células ni a un blastocito. También hay ciertas diferencias entre embriones de distintas especies ya que las curvas de congelación difieren entre ratón, bovino o humano aún tratándose del mismo tipo de estadío celular (Figura 2).
En la congelación de semen acontece algo muy similar. El esperma humano se congelo con éxito en el año 1949 y con prácticamente el mismo diseño experimental se logró congelar el semen de toro, sin embargo, el de esperma de ratón se pudo congelar recientemente en el año 1990 y aún hoy no se ha encontrado un método viable para el esperma de rata. La gran diferencia entre uno y otro es que el glicerol utilizado para congelar el semen de la mayoría de especies es tóxico para los espermatozoides de estos roedores.

Figura 3: Embriones de ratón y bovino (Foto  Dr. S. Leibo)

Principios Químicos de la Congelación: Crioprotectores

Las propiedades del glicerol como crioprotector fueron descubiertas en 1949 por los científicos Polge, Smith y Parkes. En sus estudios, este grupo, analizó la función crioprotectora de diferentes compuestos químicos durante la congelación de esperma humano y de pavo. Como muchos otros descubrimientos científicos, en que sucede lo inesperado, el glicerol por si mismo no era parte del estudio, sino que era solo un componente del fijador histológico. De manera que las muestras de semen que deberían fijarse para su estudio fueron conservadas en un refrigerador y justamente fueron en estas muestras las únicas en que los espermatozoides sobrevivieron ya que toleraron el frío.
Los crioprotectores son soluciones que protegen del frío actuando sinergicamente en la deshidratación de la célula. ¿Por que es tan importante la deshidratación parcial de la célula? Simplemente para evitar que durante el proceso de congelación se formen cristales de hielo en el interior de la célula, lo cual indefectiblemente se formarían cuando comience a congelarse el agua intracelular que contiene, por lo que en gran parte, de este fenómeno depende la viabilidad de la célula congelada.
Por esta razón se añaden al medio de congelación soluciones con función crioprotectoras. La función de estos aditivos es desplazar o extraer el agua del citoplasma y así evitar que durante la congelación se formen cristales de hielo en el interior de la célula. Estos compuestos son de variadas estructuras químicas y con diverso peso molecular. Para clasificar los crioprotectores se los puede dividir en permeables y no permeables dependiendo de su capacidad de atravesar (difusión pasiva) la membrana celular. Dentro del grupo de permeables se encuentran los polialcoholes o glicoles, como el metanol, glicerol, dimetilsulfoxido (DMSO), etilenglicol, propilenglicol.
Los clásicos no permeables son los azucares, sean monosacáridos, disacáridos o trisacáridos. También se clasifica dentro de este grupo a otras moléculas de gran tamaño como la albúmina bovina y distintos polímeros sintéticos como la polivinilpirrilidona (PVP) o polivinilalcohol (PVA) entre otros.
Idealmente un compuesto crioprotector debe ser de bajo peso molecular (MW), debe pasar a través de las membranas celulares (difusión), no ser tóxico y de alta solubilidad. Obviamente no todos los compuestos penetran la célula con la misma velocidad; por ejemplo el glicerol es más lento que el DMSO y este a su vez mas lento que etilenglicol (EG), de manera que también el volumen final de la célula se ve afectado en función del crioprotector. En otras palabras, la difusión del EG es rápida, la variación en el volumen de la célula pasa desapercibida, sin embargo con el glicerol, que difunde lentamente, se puede apreciar bajo la lupa como la célula se contrae y expande.
Los azucares tienen una solubilidad y viscosidad que depende de su estructura química, la rafinosa (trisacárido) es menos soluble que la sucrosa (disacárido) y esta es menos soluble que la glucosa (monosacárido). Los azucares son denominados búferes o tampones osmóticos; no son permeables a la membrana celular pero crean una gran presión osmótica en el medio, ante la cual la célula responde eliminando el agua para equilibrar las presiones, por lo tanto, deshidratándose.
Con esta rápida revisión de conceptos sobre criobiología, en los próximos capítulos se analizará cada método de congelación y la correspondiente descongelación para cada método independientemente.

Tipos de congelación

Si exponemos una célula a las bajas temperaturas de congelación, el medio que rodea a la célula se enfriará más rápido que el interior de la misma, por lo tanto el medio externo, al congelarse, se volverá osmóticamente más concentrado que el interior de la célula. Debido a esto, la célula reacciona eliminando el exceso de agua (contracción), y así logra que la presión producida por la concentración del medio interno se equilibre con la del medio externo (en otras palabras, que las presiones osmóticas se equiparen y mantengan un equilibrio).
Este fenómeno de reacción de la célula por equiparar la presión osmótica, sea esta hipertónica o hipotónica, puede resultar peligrosa si no es en una forma controlada. Si la deshidratación es muy rápida o extrema, el daño producido será irreversible, por lo que se hace necesario introducir en la ecuación en estudio la función de Tiempo como una nueva variable. (Figura 4).

Figura 4: Tipo de congelamiento y su efecto sobre la célula. ( Mazur 1977)

El tipo de congelación se determina conforme a la temperatura en función del tiempo, dando como resultado tres tipos de congelación: (i) lenta, (ii) rápida y, (iii) ultra rápida. En el sistema de congelación lenta, por lo general la temperatura desciende aproximadamente 0,5 ºC por minuto hasta llegar a - 80 ºC de esta manera las células tienen tiempo suficiente para eliminar el agua y equilibrarse con el medio, por lo cual se llama tambien método de congelación equilibrado. Por el contrario, en los métodos no equilibrados o rápidos la congelación ocurre más rápidamente que el tiempo requerido por las células para deshidratarse y poder equiparar la presión interna con la del medio externo, como consecuencia, se pueden formar cristales de hielo en su interior.
Es importante tener en cuenta que no todas las células tienen el mismo índice de congelación, lo que en definitiva se traduce como susceptibilidad al frío. La figura 5 muestra un clásico ejemplo de las temperaturas óptimas requeridas por distintos tipos de células.

Figura 5: Tipo de célula y curva de congelación 

En los próximos capítulos se analizaran varios protocolos de criopreservación que se utilizan en laboratorios reconocidos. Todos funcionan a un nivel similar, solo varían en la complejidad o en el equipamiento necesario. La intención es ofrecer una variedad para que se elija el más conveniente para el laboratorio. Consejo: Una vez elegido un método no mezclen rutinas con otro similar.

Bibliografía:

1. Benavides F y Guenet JL, Manual de Genética de Roedores: Principios Básicos y Aplicaciones. Eds: U. Alcalá, SECAL, Laboratory Animals Ltd. 2003.

2. Cryobiology of Embryos, Germ Cells, and Ovaries. ILAR. 41,4. 2000.

3. Glenister P and Rall W. Cryopreservation and Rederivation of Embryos and Gametes. In; Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach. Eds: Jackson and Abbot. Oxfort University Press. 2003.

4. Hogan B, Beddington R, Costantini F, Lacey E (Eds). Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual (2nd Edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1994.

5. Polge C; Smith AU; Parkes A. Revival of spermatozoa after vitrification and deshydratation at low temperatures. Nature 164, 666-668. 1949.

6. Smith AU. Biological effects of freezing and supercooling. Williams and Wilkins, eds. Baltimore 1961.

7. The Freezing of the Mammalian Embryo. Ciba Foundation Simposium 52. 1977. Eds: Elsevier/Exepta Medica, NY.

8. Whittingham DG, Leibo SP, Mazur P. Survival of Mouse embryos frozen to -196 C and -269 C. Science 178:411-414. !972.