Criopreservación de esperma

Articulos Cientificos

Autor: Jorge M. Sztein DVM, Ph.D
Director, Colony Management and Research Support
Genetic Engineering Core Facility
National Eye Institute
National Institutes of Health

Bldg 7, Room 113
Bethesda, MD 20892-0706

Hace ya miles de años que el hombre utiliza el frío o aprovecha las bajas temperaturas para la conservación de sus alimentos. Para remontarnos un poco en la historia se debe mencionar una de las primeras referencias documentadas en el uso del frío como método de preservación. Esta referencia data del año 1683 y es una monografía titulada “Nuevos experimentos y observaciones tocando el frío” publicado por Robert Boyle, el mismo quien desarrollo la famosa ley de física. Años mas tarde, en 1749 un estudio que se encuentra en el Museo de los Médicis en Florencia, Italia, atribuido a Mantegazza, describe que los soldados muertos en guerra y cubiertos de nieve mantenían espermatozoides motiles en sus testículos.

Sin embargo, la congelación del esperma de mamíferos como la conocemos hoy, recién tomo importancia en el año 1950 luego de la publicación de los estudios de Chris Polge, Audrey Smith y Allan Parkes en la que describen por primera vez la capacidad crioprotectora del glicerol. Estos estudios describen la congelación y mantenimiento a bajas temperatura del esperma humano y de pavo utilizando glicerol como agente protector a la acción del frío. Utilizando como base este importante descubrimiento del glicerol se pudo congelar el semen de la mayoría de los mamíferos, aunque, es importante destacar, que la congelación del esperma de ratón se publico por primera vez en 1990.

En los primeros intentos de criopreservación del esperma de ratón hubo muchas discrepancias entre los grupos de investigación avocados al tema. El concepto clásico de la congelación de semen de mamíferos utilizando crioprotectores permeables como el glicerol o el (dimetilsulfoxido) DMSO, tan popular y efectivo para los animales de granja como para el humano, no funciono para el ratón. Este hecho fortuito fue muy difícil de aceptar para la comunidad científica, no solo por la falta lógica y objetividad científica, sino por el hecho de la dificultad de repetir los trabajos que habían sido publicados.
En esa misma época, la técnica para producir animales transgénicos aumentaba su popularidad y creaba la imperiosa necesidad de una mejor administración del espacio en los animalarios (bioterios, estabularios, etc.). Este serio problema de súper-población hace que la criobiología tome un auge mayor y movilice a varios grupos que se proponen trabajar en el tema específicamente tratando de perfeccionar el método de congelación aplicado al esperma de ratón.

El pionero fue Okuyama quien en 1990 publico una técnica de peleteado del esperma de ratón sobre hielo seco (nieve carbónica) y luego inseminar la hembra por medio de la inseminación artificial. En este trabajo se describe por primera vez el uso de la leche descremada combinada con el azúcar rafinosa, un trisacárido, que cumple la función crioprotectora no permeable que a su vez se comporta como medio de extensión y protección del semen.

Nakagata, en 1992, perfecciono realmente el método logrando resultados más confiables y reproducibles. Simultáneamente a este trabajo se han publicado muchos otros estudios con resultados variados, sin embargo fue este método, aunque levemente modificada por varios laboratorios, que hoy en día continúa siendo el de elección y el que ofrece los mejores resultados para la congelación de semen de ratón.

Desde el punto de vista anatómico el espermatozoide del ratón tiene una morfología diferente al resto de los mamíferos. A diferencia del espermatozoide humano o de los animales de abasto que en líneas generales tiene una cabeza de forma oval con un cuello y cola de tamaño proporcionado, el espermatozoide de ratón tiene una cabeza en forma de coma, el acrosoma se extiende a lo largo de la curvatura mayor de la cabeza sobresaliendo en forma de pico, quedando de esta manera sin soporte anatómico (Figura 1) y una cola (o flagelo) extremadamente largo.

Aparentemente esta estructura acrosomica es la primera en ser dañada durante la congelación, y aunque el espermatozoide luego de descongelado mantenga su motilidad, ya que esta depende de las mitocondrias que se encuentran región del cuello, este daño hace que pierda un buen grado de fertilidad, que radica en gran parte en la integridad del acrosoma.

esperma

Figura 1: Fotografía con microscopio de barrido del espermatozoide de ratón

Los estudios y la aplicación de métodos clásicos de criobiología se vio complicada justamente por el diminuto tamaño del espermatozoide y por esta particular morfología. El método tradicional de congelación de esperma en mamíferos, vigente desde los años 50 que comúnmente utiliza glicerol como agente crioprotector, resulto ser toxico para el semen de ratón. 

Aparentemente la propiedad del glicerol de permear las membranas celulares produce un efecto perjudicial en el espermatozoide del ratón alterando la estructura biológica de la membrana celular. Diferente a lo mencionado para la congelación de embriones ya que el espermatozoide, por su conformación, no posee la misma capacidad de contraerse y expandirse que los embriones ya que la cabeza del espermatozoide contiene un medio compacto de ADN con una mínima cantidad de agua.

Tal vez, esta sea la razón de que un crioprotector permeable como el glicerol, que al igual que la mayoría de los crioprotectores permeables (poli-alcoholes) producen una diferencia de presión osmótica induciendo al intercambio entre los medios hídricos intra y extra celular, resulta perjudicial para el esperma de ratón. Los azucares, en cambio, dieron mejor resultado cumpliendo la misma función crioprotectora, particularmente la rafinosa, un trisacárido, que pertenece al grupo de crioprotectores no permeables debido al tamaño de su molécula que no pueden traspasar la membrana celular, creando una presión osmótica externa a la cual la célula responde con una leve (supuesta) deshidratación.

En la Figura 2 se grafica los resultados de un estudio comparativo entre 5 azucares y 5 poli-alcoholes en su capacidad crioprotectora para el esperma de ratón. Todos estos fueron disueltos en leche descremada ultra centrifugada. También se corroboro si la leche descremada (solución al 3%) o la lactosa (azúcar de la leche) por si misma tiene alguna protección contra los daños causados por el descenso de la temperatura. (Sztein y col).

esperma

Figura 2: Acción de distintos crioprotectores sobre la membrana del espermatozoide

La solución combinada de 3% de leche descremada y 18% de rafinosa ha demostrado ser la más eficiente para proteger al semen de ratón contra la injuria térmica producida durante la congelación. Aun así, como en toda congelación de esperma de mamíferos, esta descrito que luego de la congelación y descongelación solo sobrevive aproximadamente el 60% de la concentración espermática móvil inicial.

Además de la significativa diferencia en viabilidad y motilidad entre las muestras antes y después de congeladas ,como se puede observar en la Figura 3, se debe remarcar también las diferencias de fertilidad que existen naturalmente entre animales endocriados (endogámicos), exocriados (exogamicos) e híbridos; estos últimos de una gran fertilidad gracias a la genética de su vigor híbrido. A su vez, dentro del grupo de cepas endocriadas hay variaciones genéticas de fertilidad, yendo de muy fértil como lo es la cepa FVB/n a muy baja fertilidad como la cepa A/j o la 129 y sus variaciones. Por último, es muy importante remarcar que aún entre machos de la misma edad y misma línea genética existen grandes variaciones en concentración y motilidad espermática.

esperma

Figura 3: Diferencias de fertilidad in-vitro utilizando esperma fresco o congelado de cepas endocriadas.

Recolección de esperma en Roedores:

Para obtener el esperma se debe sacrificar el ratón ya que otros métodos aplicables en mamíferos como por ejemplo la electro eyaculación, no son técnicas aplicables en roedores.

Concretamente, para obtener el esperma se sacrifica el animal, se realiza una incisión en el abdomen, se exponen los testículos y se diseca la cola del epidídimo con o sin el conducto deferente. En el caso de que el macho sea un ejemplar único se puede sacrificar la hembra luego del apareamiento y obtener el semen lavando los cuernos uterinos.
Una vez que ambas cauda epididimidis junto con los vasos deferentes son recolectadas, eliminado todo de exceso de grasa y tejidos no propios del epidídimo se coloca en el medio crioprotector (CPA) y con el filo de una aguja hipodérmica se realizan pequeños cortes para permitir que por diferencia de presión salga el esperma de los conductillos. Se debe incubar por 10 minutos para permitir que el esperma se disperse en el medio.

Congelación del Esperma de Ratón:

La congelación propiamente dicha se realiza exponiendo la pajuela o vial que contiene la muestra de semen a los vapores de nitrógeno líquido (LN2). La muestra debe estar aproximadamente a 2 ½ cm sobre la superficie del nitrógeno líquido (LN2) (-196 °C), eso se logra apoyando las muestras sobre un flotador del grosor necesario. A este altura (2.5 cm sobre el nivel del LN2) la temperatura del vapor del LN2 crea en la muestra un descenso de temperatura de aproximadamente –20 °C por minuto, rango que ha sido demostrado como el óptimo para congelar este tipo de semen. Luego de 5 a 10 minutos de exposición a los vapores se lo sumerge en el nitrógeno líquido y se lo archiva depositándolo en la fase líquida del LN2.
La descongelación se realiza en forma rápida, pasando del LN2 a un baño de agua a 37 °C. Una vez que la muestra esta descongelada completamente, se centrífuga a bajas revoluciones (750 g X 3 minutos) para no dañar los espermatozoides; se descarta el crioprotector y se reemplaza con el mismo medio de cultivo con que se realizara la fecundación in vitro (FIV) y se incuba a 37 °C por 10 minutos. De esta forma se estimula a los espermatozoides que sobrevivieron a nadar hacia la superficie logrando una separación grosera entre los espermatozoides vivos y los muertos, que quedaran depositados en el fondo del tubo.

PROTOCOLO DE CRIOPRESERVACIÓN DE ESPERMA DE RATÓN
MATERIAL
  • Machos de 4 a 8 meses de edad, que se hayan mantenido individualmente al menos una semana.

  • Solución crioproctetora (CPA).

  • Placas de Petri de 35 mm de diámetro.

  • Medio adecuado para la posterior fertilización in vitro (HTF o similar).

  • Material de disección.

  • Incubador de 37ºC con fase gaseosa de 5% de C02.

  • Centrífuga Eppendorf.

  • Baño de 37º C.

  • Criotubos de 1.8 ml de Nunc, # 363401 o pajuelas para semen.

  • Micropipetas y puntas de boca ancha (por ejemplo, Rainin HR-250W).

  • Contenedor de N2 líquido con un flotador que permita mantener los criotubos 1 cm sobre la superficie del N2.

OBTENCIÓN Y CONGELACIÓN DE ESPERMA
  • Sacrificar un macho y diseccionar asépticamente los vasos deferentes y la cola (cauda) de los epidídimos, eliminando todos los restos de grasa y de sangre.

  • Transferir los epidídimos y vasos deferentes a una placa p-35 que contenga 1 ml de solución cryoprotectora, calentado previamente a 37ºC. Cortar cada epidídimo y vaso varias veces con la punta de una aguja de 30G para que el esperma pueda salir.

  • Incubar la placa durante 10 minutos a 37ºC para permitir la dispersión del esperma (swim out).

  • Homogeneizar el esperma en el CPA agitando levemente la placa con la mano; distribuir en alícuotas de 100 ml en criotubos convenientemente marcados.

  • Situar los viales en vapores de N2 sobre un flotador situado a 1 cm de la superficie, durante 10 minutos. En estas condiciones la temperatura de los vapores es de aproximadamente –120ºC y la congelación va progresando a razón de 20-40ºC por minuto.

  • Sumergir directamente en N2 líquido y guardar.

DESCONGELACIÓN
  • Descongelar rápidamente las muestras congeladas pasándolas directamente desde el N2 líquido a un baño a 37ºC hasta que todo el hielo haya desaparecido (aproximadamente 1 min.)

  • Transferir la muestra a un tubo de centrífuga (eppendorff) y centrifugar 5 minutos a 735xg (3000rpm en una microcentrífuga Eppendorf).

  • Eliminar el sobrenadante (crioprotector) con cuidado y añadir 50ml de medio HTF o el que se vaya a usar en la fertilización in vitro.

  • Resuspender ligeramente el pellet e incubar el tubo al menos 10 min. a 37ºC en el incubador para que los espermatozoides viables queden libres en el sobrenadante, (swim up).

  • Utilizar 40ml para el ensayo de IVF; evaluar la morfología y motilidad de los espermatozoides, así como su concentración.

 

Fuente: Basado en: J.M. Sztein et al. (1997), Cryobiology 35: 46-52 y JM. Sztein et al. (2000), Biol Reprod 63, 1784-1790

Referencias:

Polge C; Smith AU; Parkes A. Revival of spermatozoa after vitrification and deshydratation at low temperatures. Nature 164, 666-668 (1949).
Smith AU. Biological effects of freezing and supercooling. Williams and Wilkins, eds. Baltimore 1961.

Algunos trabajos publicados sobre congelación de semen de ratón:

  1. Devireddy RV, Swanlund DJ, Roberts KP, Bischof JC. Subzero water permeability parameters of mouse spermatozoa in the presence of extracellular ice and cryoprotective agents. Biol Reprod 1999; 61:764–775.

  2. Fuller SJ, Whittingham DG. Effect of cooling mouse spermatozoa to 48C on fertilization and embryonic development. J Reprod Fertil 1996; 108:139–145.

  3. Nakagata N, Takeshima T. High fertilizing ability of mouse spermatozoa diluted slowly after cryopreservation. Theriogenology 1992; 37: 1283–1291.

  4. Nakagata N, Takeshima T. Cryopreservation of mouse spermatozoa from inbred and F1 strains. Exp Anim 1993; 42:317–320.

  5. Nakagata N. Use of cryopreservation techniques of embryos and spermatozoa for production of transgenic (Tg) mice and for maintenance of Tg mouse lines. Lab Anim Sci 1996; 46:236–238.

  6. Nakagata N, Okamoto M, Ueda O, Suzuki H. Positive effect of partial zona-pellucida dissection on the in vitro fertilization capacity of cryopreserved C57BL/6J transgenic mouse spermatozoa of low motility. Biol Reprod 1997; 57:1050–1055.

  7. Marrschall S, Hrabe de Angelis M. Cryopreservation of mouse spermatozoa— double your space. Trends Genet 1999; 15:128–131.

  8. Marshal S, Huffstadt U, Balling R, Hrabe de Angelis M. Reliable recovery of inbred lines using cryopreserved spermatozoa. Mamm Genome 1999; 10:773–776.

  9. Okuyama M, Isogai S, Saga M, Hamada H, Ogawa S. In vitro fertilization (IVF) and artificial insemination (AI) by cryopreserved spermatozoa in mouse. J Fertil Implant (Tokyo) 1990; 7:116–119

  10. Penfold LM, Moore HD. A new method for cryopreservation of mouse spermatozoa. J Reprod Fertil 1993; 99:131–134.

  11. Phelps MJ, Liu J, Benson JD, Willoughby CE, Gilmore JA, Critser JK. Effects of Percoll separation, cryoprotective agents and temperature on plasma membrane characteristics of murine spermatozoa and their relevance to cryopreservation. Biol Reprod 1999; 61:1031–1041.

  12. Songsasen N, Leibo SP. Cryopreservation of mouse spermatozoa. II. Relationship between survival after cryopreservation and osmotic tolerance of spermatozoa from three different strains of mice. Cryobiology 1997; 35:255–269.

  13. Sztein JM, Farley JS, Young AF, Mobraaten LE. Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing. Cryobiology 1997; 35:46–52.

  14. Sztein JM, Farley JS, Mobraaten LE. 2000. In Vitro Fertilization with Cryopreserved Inbred Mouse Sperm. Biol. Reprod. 63, 1774-1780.

  15. Sztein JM, Noble K, Farley JS, Mobraaten LE. 2001. Comparison of permeating and nonpermeating cryoprotectants for mouse sperm ccryopreservation. Cryobiology 41, 28-39.

  16. Tada N, Sato M, Amann E, Ogawa S. Effect of pre-freezing equilibration and post-thawing centrifugation on the fertilizing capacity of frozen mouse epididymal spermatozoa. Cryo Lett 1993; 14:195–206.

  17. Tada N, Sato M, Yamanoi J, Mizorogi T, Kasi K, Ogawa S. Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol. J Reprod Fertil 1990; 89:511–516.

  18. Takeshima T, Nakagata N, Ogawa S. Cryopreservation of mouse spermatozoa. Exp Anim 1991; 40:493–497

  19. Thornton CE, Brown SDM, Glenister PH. Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resources banks, mutagenics screens and mouse backcrosses. Mamm Genome 1999; 10:987–992.

  20. Watson PF. Recent developments and concepts in the Cryopreservation of spermatozoa and the assessment of their post-thawing function. Reprod Fertil Dev 1995; 7:871–891.

Algunos trabajos publicados en FIV y medios de cultivo:

  1. Ho Y, Wigglesworth K, Eppig JJ, Schultz RM. Preimplantation development of mouse embryos in KSOM: augmentation by amino acids and analysis of gene expression. Mol Reprod Dev 1995; 41: 232–238.

  2. Hoppe PC. Genetic influences on mouse sperm capacitation in vivo and in vitro. Gamete Res 1980; 3:343–349.

  3. Fraser RL, Drury LM. The relation between sperm concentration and fertilization in vitro of mouse eggs. Biol Reprod 1975; 13:513–518.

  4. Fraser LR. Differing requirements for capacitation in vitro of mouse spermatozoa from two strains. J Reprod Fertil 1977; 49:83–87.

  5. Kaleta E. Influence of genetic factors on the fertilization of mouse ova in vitro. J Reprod Fertil 1977; 51:375–381.

  6. Kasai K, Minato Y, Toyoda Y. Fertilization and development in vitro of mouse eggs from inbred strains and F1 hybrids. Jpn J Anim Reprod 1978; 28:19–22

  7. Niwa K, Araki M, Iritani A. Fertilization in vitro of eggs and first cleavage of embryos in different strains of mice. Biol Reprod 1980; 22:1155–1159.

  8. Parkening TA, Chang MC. Strain differences in the in vitro fertilizing capacity of mouse spermatozoa as tested in various media. Biol Reprod 1976; 15:647–653.

  9. Quinn P, Kerin JF, Warnes GM. Improved pregnancy rate in human in vitro fertilization with the use of a medium based on the composition of human tubal fluid. Fertil Steril 1985; 44:493–498.

  10. Roudebush WE, Duralia DR. Superovulation, fertilization, and in vitro embryo development in BALB/cByJ, BALB/cJ, B6D2F1/J and CFW mouse strains. Lab Anim Sci 1996; 46:239–240

  11. Stanger JD, Quinn P. Fertilization of cumulus-free, zona intact mouse ova in vitro at high and low sperm concentrations. Gamete Res 1982; 5:61–70.

  12. Hoppe PC, Pitts S. Fertilization in vitro and development of mouse ova. Biol Reprod 1973; 8:420–426.

Comentarios

Seguiremos ofreciendo un espacio para todos aquellos que quieran participar y colaborar en esta cruzada educativa, porque tenemos muy claro que estaremos constantemente: “Aprendiendo de los Animales de Laboratorio”.

Suscribir a Magazine

Back to Top